从0入门,掌握CUT&RUN技术成功指南

来源: Cell Signaling Technology (CST)   2020-8-27   访问量:466评论(0)

与染色质免疫沉淀 (ChIP) 检测一样,核酸酶靶向切割和释放 (CUT&RUN) 是一项用于在细胞天然染色质环境下检测蛋白-DNA相互作用的强大通用技术(1-4)。CUT&RUN技术检测范围更广,且提供了一种更快速、更可靠、真正的低细胞数测定法,可在一天之内完成从活细胞到纯化 DNA 的过程,且经证明每次检测只需使用少至 500-1000 个细胞 (1,2)。

 

那么,CUT&RUN原理和步骤是什么?它与其他DNA-蛋白质互作研究方案相比有哪些优点?它又是如何利用染色质抗体靶向消化方法使背景信号更低的呢?在设计实验时需要考虑什么确保实验结果真实可靠该讲座将从0开始,带你领略CUT&RUN的魅力!赶快学习收藏吧!

 

点我,看CUT&RUN 网络研讨会回放(微信原文)

 

活动报名和参与直播人数众多,在现场我们收到老师和同学的许多问题,也许您也有此疑问,所以罗列如下(按提问顺序排列):

 

 

01
Q&A


“CUT&Tag 和 CUT&RUN 这两个技术,可以用于研究像HBV病毒这种小的环状DNA的转录因子结合情况么?”

目前我们还没有看到用CUT&RUN 或者CUT&Tag类实验针对病毒材料样本做研究的。一个可能原因是CUT&RUN 或者CUT&Tag需要在细胞核结构内利用酶对比较大的动植物gDNA进行剪切,释放小片段进行检测。CUT&RUN是剪切之后gDNA被剪切的片段同蛋白复合物进行释放。CUT&Tag是剪切之后,进行tagmentation操作后再进行释放。

02
Q&A


“ CUT&RUN 与 ChIP-seq 建库、测序以及分析方法是否完全一样,只是reads减少吗?”
CUT&RUN 和ChIP(酶解、超声)得到的DNA的片段化长度是不一样的,因此拿到DNA之后建库的时候也要做针对性的优化。具体参考官网说明书VIIC&R中文说明书下载(仅供参考)。如果C&R得到的DNA量很少,可以参考CST建库试剂盒说明。两者测序后分析方法类似。

03
Q&A


“Digitonin反复高温加热有没有影响?”
CST内部测试过延长Digitonin加热时间,对实验没有明显影响。因此相对于加热,更担心的是不完全溶解造成样本通透不足。
04
Q&A


“ CUT&RUN 可以用于动物组织吗?冻存的组织可以吗?”
CST内部目前没有对动植物组织测试成熟的protocol。但是已有文献报道CUT&RUN可以用于组织样本(参见:https://epigeneticsandchromatin.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13072-018-0243-8)。做组织可能需要将组织匀浆成少量细胞的团块(单细胞悬浮液)。另外,CST最近也成功测试过一些交联样本用于CUT&RUN,交联之后DNA-蛋白互作会更稳定维持。交联和冻存操作可能会影响DNA-蛋白互作和细胞状态及膜的通透性,这些都是在自行优化protocol的时候需要考虑的事项。

 

05
Q&A


“ Input组细胞不能用CST提供的柱子纯化吗?”
这取决于Input gDNA有没有被片段化过。CST目前的ChIP和C&R纯化柱适合于10kb以下片段。如果Input样品经过超声或者酶解片段化处理,则可以使用CST柱子纯化。如果Input gDNA为完整的基因组,应该使用大片段的纯化方法(比如gDNA柱纯化和苯酚氯仿纯化)。

 

06
Q&A


“ CUT&RUN 测定法如何明确某种特殊蛋白-DNA 相互作用的空间和时间关系?”
CUT&RUN最终的结果解读是用测定切下来的DNA序列或者含量来解读的。但实验过程受到抗体是否适用于C&R、样本状态等有区别。因此如果要解析结合的时间关系,可以通过制备不同处理状态的细胞样本来推定。空间方面一定程度上可以通过最终得到DNA序列状态来解读。

07
Q&A


“ CUT&RUN 测定法在用于分析转录因子和辅因子结合、DNA 复制因子和 DNA 修复蛋白的结合时的注意事项,动植物细胞的实验处理区别和特别要注意的地方?”
CUT&RUN用于不同靶蛋白,会有产物DN**段大小和DNA得率的区别。目前从CST的经验来看转录因子类富集的片段大小峰值在80-100bp左右,产量1个反应0.5-10ng。组蛋白修饰富集片段大小峰值在100-150bp左右,产量1个反应1-20ng。根据片段大小和产量可以适当参考选择纯化方法、PCR分析的引物扩增子、DNA测序文库构建的温度设置,详见说明书。对哺乳动物细胞样本,参考说明书即可。如果是植物样本,可以参考文献:Zheng, X-Y, . et al. (2019) Plant Reprod, 32(1):63-75.

 

08
Q&A


“ CUT&RUN 测定法检测时对细胞量的需求是需要严格控制吗?必须在大于等于 500-1000 个,细胞数量过多是否会有影响?比如植物组织怎样确定细胞数?”
CST的CUT&RUN说明书中1个反应所建议的细胞量是1万-25万个细胞量,如果细胞数量在1万-10万,则无需降低体系(体系太小不便于移液等操作)。若超过25万个细胞,可以考虑体系等比放大。若细胞数量小于1万,可以参考文献Skene, P.J. et al. (2018) Nat Protoc 13, 1006-19. 或CST说明书直接自行尝试,但CST无法保证极低细胞量的实验成功。如果是植物样本,可以参考文献:Zheng, X-Y, . et al. (2019) Plant Reprod, 32(1):63-75.

 

09
Q&A


“CUT&RUN 测定法是否只能用于已知蛋白因子的研究?”
CUT&RUN 测定法需要用到针对蛋白的抗体,或者采用有Tag标签的重组蛋白的Tag标签抗体进行实验。CST已经验证通过了数十个可用于CUT&RUN的抗体。因此适用于针对已知蛋白,对蛋白-DNA复合物进行研究。如果蛋白未知,可以考虑用Pull-down等方法进行研究。

 

10
Q&A


“ 试剂盒中的亚精胺因为操作失误用完了,可以单独购买吗?或是自己配置吗?”
可以单独定制购买,具体请联系CST销售。

 

11
Q&A


“ 正对照只能选择H3K4me3吗?”
Total Histone H3 在CUT&RUN反应中表现不佳。这点得到CST内部验证和Henikoff实验室的双重确认,因此我们不建议选择Histone H3作对照。和ChIP不一样,在CUT&RUN中我们没有一个针对任何引物都适用的真正意义上的阳性对照抗体。因而,我们选择了一个最容易操作成功率最高的组蛋白修饰H3K4me3并且配备了相应的阳性对照引物。其在全基因组内的结合区域,有阴性和阳性的区域,更方面测序时在整个基因组内观察计算信噪比。如果选用其它组蛋白修饰抗体作为实验对照(如H3K27me3或者H3K36me等等),需要自行考虑以下两个因素:1,要自行设计针对此阳性对照抗体的阳性引物(每种不同修饰组蛋白其DNA结合位点不同);2,要考虑这个抗体是否在CUT&RUN中得到验证并持续稳定产生强信号。
12
Q&A


“报名页面有PPT可以下载吗?”
报名页面已添加下载链接,未看直播的用户,点我免费下载PPT

 

 

 

 

 

 

 

嘉宾简介


 

 

 

 

 

陈芳 博士 CST Senior Development Scientist

博后: 耶鲁大学

 

 

 

博士: 中科院上海生命科学研究院
陈芳博士,现任Cell Signaling Technology美国总公司资深研发科学家,具有10年以上表观遗传相关技术的研发与应用经验,对在植物,癌细胞,动物组织等各种材料中蛋白质与DNA的互作都具有深厚的学术积累。组织参与了CST各种表观试剂盒及相关抗体的研发和验证,包括CUT&RUN试剂盒,酶解ChIP试剂盒,超声ChIP试剂盒,测序文库制备试剂盒等。此外陈芳博士长期活跃于客户服务和技术支持的一线,直接接触来自全球的大量科研用户,深谙实验痛点,积累了丰富的研发经验及产品知识,希望能为广大科研工作者提供帮助。

 

 

 

 

 

参考文献

1.Skene, P.J. and Henikoff, S. (2017) Elife 6, pii: e21856. doi: 10.7554/eLife.21856.

2.Skene, P.J. et al. (2018) Nat Protoc 13, 1006-19.

3.Meers, M.P. et al. (2019) Elife 8, pii: e46314. doi: 10.7554/eLife.46314.

4.Meers, M.P. et al. (2019) Mol Cell 75, 562-575.e5.



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